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怎样做好药敏试验(K-B法)

怎样做好药敏试验(K-B法)


近年来,细菌感染性疾病严重威胁着人类的健康,抗生素的合理使用是治疗和控制此类疾病的有效手段,抗生素体外药敏试验结果的正确与否对抗生素的选择至关重要,药敏试验的结果受到诸多因素的影响,如培养基、试纸片以及菌液的浓度等。


 1、培养基


细菌药敏试验所用的培养基种类较多,多数情况下,采用WHO组织统一要求的M-H培养基,这种培养基中含有的低胸腺嘧啶是与磺胺类药物竞争的物质,因此进行的药敏试验效果较好。此外,还有适量的Ca2+、Mg2+,在培养基中起到触媒的作用。但是,有些细菌对培养基中的成分有特殊的要求,特殊的菌要用特殊的培养基才能进行药敏试验。例如,流感嗜血杆菌的药敏试验培养基用HTM琼脂;淋球菌的药敏试验培养基用加5%羊血的巧克力M-H琼脂;肺炎链球菌的药敏实验用M-H琼脂加5%的脱纤维羊血培养基。培养基中还有适量的Ca2+、Mg2+,在培养基中起到溶酶的作用,其含量的变化,可影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞菌的试验结果,含量过高,抑菌圈会变小,含量过低,抑菌圈会大得不可接受。


细菌药敏试验的培养基厚度大约为4mm,若培养基厚度大于4mm,会使细菌出现耐药;若小于4mm,本应耐药的易出现敏感。所以,试验时一定不要把药敏纸片放在中央部位,而应均匀地排布在平皿周围的培养基上。制作药敏试验的培养基用水,主要是Ca2+、Mg2+等矿物质离子,也在很大程度上影响着药敏试验的结果。


2、试纸片


试纸片材质的好坏,对药物稳定性和活性有很大影响。加工药敏试纸片的试纸一般是使用加厚型的滤纸,杂质少,对药物保存无太大影响。然而,临床中很多用的是普通纸,被水浸润后会呈碱性,并且含有大量无机离子,因此使用普通纸加工的试纸片药物有较大的影响。药敏纸片的PH值一般要求为中性,这样才适合药的活度。药敏纸片的厚度要求大约1mm,这样才有利于细菌的生长和药物的扩散速度。药敏纸片的直径在6.00~6.35mm之间,纸片的厚度和直径大小都会影响药敏试验的结果。


含药纸片的片间差和质量好坏是做药敏试验的关键。一些药敏纸片买来时就有抑菌环偏大或偏小的问题,纸片之间又存在很大的片间差。因此,纸片在用前必须检验其片间差和准确度,只有都达到标准要求后才能使用。同时要注意纸片的保存,因为有的纸片,如青霉素类,在保存中因为受潮湿环境的影响容易降低其药物的活性。因此,纸片应放低温下(-10℃)保存,同时要避免潮湿,以保持抗菌药物的活性。盛纸片小瓶自低温处取出应在室温平衡至少10min后再打开,避免冷凝水影响药效。


3、细菌


由于各种菌对药物的敏感性不同,产生的抑菌环大小不同,如果菌种不纯,试验中所产生的抑菌环大小与该菌种在纯培养状态下产生的抑菌环大小存在较大的差异,影响判断结果的准确性。因此需要对各种致病菌提纯后,分别进行不同的药敏试验。药敏试验时,需要将提纯后的菌种配制成一定浓度的菌液。WHO组织制定的标准是要求菌液浓度在1.5亿/ml左右。若菌液浓度过高,该菌会对所有药物产生耐药;反之,菌液浓度过低,该菌会对所有药物均敏感。最精确的方法是使用分光光度计测定新鲜培养物菌悬液的吸光度,来确定菌液浓度。国家细菌耐药性监测网的三级甲等医院,其微生物实验室大多数用此法来确定药敏试验的菌液浓度。


药敏试验中要将菌液均匀地涂在培养基上,使细菌均匀分布,这样才能使试验结果不会出现较大的偏差。涂菌后15min才能贴药敏纸片。由于涂菌后,细菌要有一段时间的适应过程,但是时间不能过长,否则会使细菌产生耐药。贴药敏纸片时,每取一种药敏纸片必须烧一下镊子口,避免药敏纸片之间相互混淆,以提高药敏的准确性。药物杀灭细菌存在一定的量比,药敏试验培养基上细菌层越厚抑菌圈就越小,反之抑菌圈就越大。根据一种药物抑菌圈的有无或者大小,只能判断出该药对细菌有没有效果,但其敏感性的高低需要通过科学严谨的实验来确定。药物的敏感程度需要根据药敏试验的结果,并结合以上因素做综合分析,才能得出科学的结论,而片面地根据药敏圈的大小来决定敏感与否,结果不够准确。



综上所述,造成药敏试验的结果可能与实际效果不符,对药敏试验要具体情况进行相应的分析,再根据药物的代谢过程和原理综合论证,药敏试验的指导意义还是很大的。而且上述因素并不是在我们临床做药敏试验过程中都能遇到,对此,我们需要认真执行标准化的试验方法,认真执行CLSI质控要求,做好室内质控与室间质评,以提高试验的准确性。严格控制药敏试验用培养基和药敏纸片,做到保证质量。


来源:医学检验圈BY华通医疗


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